Kromatografi kolom: Perbedaan antara revisi

[[Berkas:FDA_History_-_Column_Chromatography.jpg|rightka|thumbjmpl|Seorang kimiawan menggunakan kromatografi kolom tahun 1950an. Erlenmeyer penampung terletak di lantai.]]

[[Berkas:Fraction_collector_-_sampler_LAMBDA_OMNICOLL.jpg|rightka|thumbjmpl|Pengumpul fraksi dan sampler otomatis untuk teknik kromatografi]]

Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara 5  mm hingga 50  mm dengan panjang 5  cm hingga 1 m dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca  – untuk mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah. Dua metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom adalah: metode kering dan metode basah.

Komponen-komponen tunggal tertahan oleh fasa diam secara berbeda satu sama lain pada saat mereka bergerak bersama eluen dengan laju yang berbeda melalui kolom. Di akhir kolom, mereka terelusi satu per satu. Selama keseluruhan proses kromatografi, eluen dikumpulkan sesuai [[Fraksionasi|fraksi-fraksinya]]. Fraksi-fraksi dapat dikumpulkan secara otomatis oleh pengumpul fraksi. Produktivitas kromatografi dapat ditingkatkan dengan menjalankan beberapa kolom sekaligus. Di sini, diperlukan pengumpul multi aliran. Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan masing-masing fraksi dianalisadianalisis senyawa terlarutnya, misalnya dengan kromatografi, absorpsi sinar [[UV]] atau [[fluoresensi]]. Senyawa berwarna (atau senyawa berfluoresensi di bawah lampu UV) dapat terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita bergerak.

[[Berkas:Column_chromatography_sequence.png|thumbjmpl|600x600px|Tahapan pengerjaan kromatografi kolom]]

[[Berkas:Cromatografia_su_colonna.jpg|thumbjmpl|Foto urutan kromatografi kolom]]

''Fasa gerak'' atau [[Eluen|''[[eluen'']]'' dapat berupa [[pelarut]] murni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai [[faktor retensi]] senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan [[kromatografi lapisan tipis]] (KLT) dengan fasa gerak yang sama.

Ada [[Laju alir volumetrik|laju aliran]] optimum untuk masing-masing pemisahan. Semakin cepat [[Laju alir volumetrik|laju aliran]] eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak, lihat [[persamaan Van Deemter]]. Kolom laboratorium sederhana bekerja dengan prinsip aliran [[gravitasi]]. Laju aliran kolom semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah. Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya: udara, [[nitrogen]], atau [[argon]]) untuk menekan pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat).<ref>Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A.  ''[[:en:J._Org Org._Chem Chem.|J. Org. Chem]].''  '''1978''',  ''43(14)'', 2923-2925. ([[Pengenal objek digital|doi]]:[[doi:10.1021/jo00408a041|10.1021/jo00408a041]])</ref><ref name="HarwoodMoodyEOCPAP">Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody (13 Jun 1989).  ''Experimental organic chemistry: Principles and Practice''  (Illustrated ed.). pp.  180–185.  [[ISBN]]  [[:en:Special:BookSources/978-0-632-02017-1|978-0-632-02017-1]].</ref>

Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya lebih halus daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel untuk kromatografi kilat berukuran antara   230 – 400 mesh (40 – 63&nbsp;µm), sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70 – 230 mesh (63 – 200&nbsp;µm).<ref>Normal phase column chromatography, [http://www.materialharvest.com/welcome/silica_products/silica_gels_chromatography.html Material Harvest]</ref>

Telah dikembangkan lembar lajur (''spreadsheet'') yang mendukung suksesnya pengembangan kolom kilat. Lembar lajur memperkirakan volume retensi dan pita volume analit, jumlah fraksi yang diperkirakan untuk masing-masing kandungan analit, dan resolusi antara dua puncak yang berdekatan. Informasi ini memungkinkan pengguna memilih parameter optimal untuk pemisahan berskala preparatif sebelum dicobakan pada kolom kilat.<ref>Fair, J. D.; Kormos, C. M.  ''[https://en.wiki-indonesia.club/w/index.php?title=J._Chromatography._A&action=edit&redlink=1 J. Chromatography]. A''  '''2008''',  ''1211''(1-2), 49-54. ([[Pengenal objek digital|doi]]:[[doi:10.1016/j.chroma.2008.09.085|10.1016/j.chroma.2008.09.085]])</ref>

[[Berkas:Metrohm_850.jpg|rightka|thumbjmpl|Sistem kromatografi ion otomatis]]

Resolusi (kemampuan memisahkan campuran) pada sistem LPLC pasti lebih rendah dari padadaripada KCKT, karena bahan kemasan dalam kolom KCKT dapat lebih kecil, biasnya hanya 5 mikrometer sehingga meningkatkan luas permukaan fasa diam, meningkatkan luas permukaan interaksi dan pemisahan menjadi lebih baik. Namun, penggunaan media berkemasan kecil ini menyebabkan tekanan balik yang tinggi dan itulah mengapa disebut kromatografi cair tekanan tinggi. Kolom LPLC biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan kebutuhan pompa bertekanan tinggi yang mahal. Pabrikan juga sekrang mulai berpindah kepada sistem kromatografi kilat bertekanan tinggi dan memberinya nama sistem kromatografi cair tekanan menengah ({{lang-en|medium pressure liquid chromatography, MPLC}}) yang beroperasi pada tekanan di atas 1 Mpa (150 psi).

[[Berkas:Feinpulvriges_Silicat.jpg|thumbjmpl|Serbuk [[silikat]] untuk kromatografi kolom]]

Sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas ikatan terhadap kolom yang berbeda dari suatu larutan, jenis detektor yang baik adalah spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 &nbsp;nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang melalui kolom, semakin besar absorbansinya pada panjang gelombang tersebut.

Metode yang sudah disederhanakan dalam menghitung resolusi kromatogram adalah menggunakan model pelat.<ref name="Harrison">Harrison et al.  ''Bioseparations Science and Engineering''. Oxford University Press. New York, New York. 2003 </ref> Model pelat berasumsi bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah seksi tertentu, atau pelat, dan kesetimbangan massa dapat dihitung untuk masing-masing pelat tunggal. Pendekatan ini memperkirakan kurva kromatogram sebagai kurva [[distribusi Gaussian]]. Dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan 4 kali standar deviasi kurva,  4σ. Waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal hingga waktu di titik puncak kurva Gaussian.

R_s = {{frac2|2(t_RB – t_RA)|(w_B + w_A)}}

dengan:

dengan L adalah panjang kolom.<ref name="Harrison">Harrison et al. ''Bioseparations Science and Engineering''. Oxford University Press. New York, New York. 2003 </ref>

Untuk sebuah kolom adsorpsi, resin kolom (fasa diam) tersusun atas butiran mikro (''microbead''). Bahkan partikel-partikel yang lebih kecil seperti protein, karbohidrat, ion logam, atau senyawa kimia lainnya berkonjugasi pada ''microbead''  ini. Masing-masing partikel yang terikat pada ''microbead''  diasumsikan dapat mengikat solut sampel yang akan dimurnikan atau dipisahkan dengan rasio 1:1, dialirkan melalui kolom.

Ikatan antara molekul target yang akan dipisahkan dengan molekul yang terikat pada ''microbead''  dapat dituliskan sebagai reaksi kesetimbangan sederhana  K_eq = {{frac2|[CS]/|([C][S])}} dengan K_eq adalah [[tetapan kesetimbangan]], [C] dan [S] adalah konsentrasi molekul target dan molekul yang terikat pada resin kolom. [CS] adalah konsentrasi senyawa kompleks molekul target yang terikat pada resin kolom.<ref name="Harrison" /><span class="cx-segment" data-segmentid="184"></span>

Untuk penggunaan skala industri, total molekul terikat pada butiran resin harus diperhitungkan karena ruang-ruang kosong harus diperhitungkan. Isotermal Langmuir dan isotermal Freundlich berguna untuk menjelaskan kondisi kesetimbangan ini. Isotermal  Langmuir:

[CS] = {{frac2|(K_eqS_tot[C])/|(1 + K_eq[C])}}, dengan S_tot  total molekul terikat pada butiran penyangga fasa diam.

[[Kategori:TeknikMetode laboratorium]]