DNA komplemen: Perbedaan antara revisi

Jelajahi riwayat secara interaktif

← Revisi sebelumnya

Konten dihapus Konten ditambahkan

VisualTeks wiki

Revisi per 11 April 2014 14.27 sunting BP60Fita (bicara \| kontrib) 490 suntingan Tidak ada ringkasan suntingan Tag: BP2014 ← Revisi sebelumnya		Revisi terkini sejak 17 Desember 2023 09.22 sunting balikkan JumadilM (bicara \| kontrib) Pengecualian blokir IP, Peninjau 46.867 suntingan mengubah istilah ke dalam bahasa Indonesia Tag: VisualEditor
(30 revisi perantara oleh 9 pengguna tidak ditampilkan)
Baris 1: [[Berkas:Visualisasi cDNA.jpg\|jmpl\|Visualisasi hasil sintesis cDNA untai pertama]] ~~{{inuseBP \|BP60Fita\| 26 April 2014\| 9 April 2014}}~~ '''DNA komplemen''' atau '''DNA pelengkap''', atau jauh lebih dikenal dengan singkatannya '''cDNA''' (dari ''complementary DNA''), merupakan DNA ~~berkas~~untai tunggal ~~(''single-stranded'')~~ sintetik/buatan yang disalin dari ~~berkas~~untai [[~~RNA~~mRNA]] menggunakan teknik [[PCR]] ~~dan~~dengan memanfaatkan [[enzim]] ''[[~~reverse~~transkriptase ~~transcriptase~~balik]]''.<ref name="Xu">{{en}} Xu Yunbi. 2010. Molecular Plant Breeding. Oxford (UK): CABI.</ref> Penggunaan cDNA ini sangat luas, terutama dalam analisis [[ekspresi genetik]] dan [[transkriptomika]].<ref ~~RNA~~name="Xu"/> mRNA berkas tunggal atau transkriptom bersifat tidak stabil karena mudah dicerna dan dilebur dalam [[sel (biologi)\|sel]]. Pengubahan ~~RNA~~mRNA berkas tunggal menjadi cDNA membuatnya lebih mudah dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur).<ref name="Xu"/> == Sintesis == sintesis cDNA untai pertama diperlukan untuk menstabilkan mRNA yang didapatkan. Hal ini dilakukan dengan mengunakan enzim reverse transcriptase dan primer oligo dT yang akan menempel pada daerah poli A tail yang merupakan ciri khas dari mRNA sehingga semua mRNA akan ditranskrip menjadi cDNA untai pertama sehingga selanjutnya dapat dilakukan PCR kembali untuk mencari cDNA yang diingikan. Dalam mensintesis cDNA total, diperlukan mRNA total sebagai template. mRNA eukariotik umumnya memiliki ujung 3’ yang telah mengalami poliadenilasi sehingga membentuk poly(A) tail, sedangkan tipe RNA lain seperti rRNA dan tRNA tidak memiliki bagian tersebut. Poli A pada ujung 3’ mRNA penting dalam proses purifikasi mRNA dari ekstrak total RNA tipe sel spesifik dan umumnya purifikasi dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi afinitas (Allison 2007). Sintesis cDNA ini dilakukan dengan mengunakan [[enzim]] [[reverse transcriptase]] dan [[primer]] [[oligo dT]] yang akan menempel pada daerah [[ekor poli A]] yang merupakan ciri khas dari mRNA. Hal ini dilakukan supaya mRNA yang digunakan dapat di [[amplifikasi]] saat dilakukan pengecekan dengan menggunakan PCR.<ref name="Allison">{{en}} Allison LA. 2007. Fundamental Molecular Biology. Blackwell: Oxford.</ref> Dalam melakukan sintesis cDNA diperlukan beberapa tahapan, yaitu [[isolasi]] mRNA yang akan digunakan, [[visualisasi]] dengan menggunakan [[elektroforesis]], sintesis cDNA untai pertama dan [[amplifikasi]] cDNA yang didapatkan.<ref name="Allison"/> Setelah didapatkan mRNA murni, terdapat beberapa tahap dalam mensintesis cDNA total, tahap pertama adalah sintesis pita/ untaian pertama cDNA (first strand synthesis of cDNA). Dalam tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari template mRNA dengan bantuan primer oligo (dT) yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA. Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa. Tahapan kedua adalah sintesis pita/ untaian kedua cDNA (second strand synthesis of cDNA). Tahapan ini menggunakan metode self-priming yaitu menggunakan primer yang berasal dari dirinya sendiri. Terdapat 2 enzim yang berperan, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow fragment) dan S1 nuklease. Enzim DNA polymerase I merupakan enzim yang memiliki aktivitas 5’ – 3’ polymerase dan 3’ – 5’ eksonuklease, enzim ini akan mensintesis second strand dari ujung 3’ menggunakan hairpin yang terbentuk secara alami dari first strand sebagai primer, kemudian hairpin tersebut akan dipotong menggunakan S1 nuklease, sehingga menghasilkan cDNA beruntai ganda (Allison 2007). * isolasi mRNA: mRNA yang digunakan merupakan hasil [[isolasi]] dari eukariot. mRNA digunakan karena lebih spesifik terhadap [[ekspresi gen]] yang dihasilkan.<ref name="Allison"/> mRNA digunakan karena pada mRNA terdapat ekor polyA karena adanya proses [[poliadenilasi]] yang tidak dimiliki oleh RNA lainnya, seperti [[rRNA]] dan [[tRNA]].<ref name="Allison"/> Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah terdegradasi, selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat permanen. cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai vector kloning seperti plasmid, kosmid, dan bakteriofage, dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA genomic yang kompleks. Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ sekuens yang terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon (Farrell 2010).▼ * visualisasi: menggunakan gel [[agarosa]] untuk mengetahui hasil isolasi.<ref name="Allison"/> * sintesis cDNA untai pertama: pada tahapan ini diperlukan [[enzim]] reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal [[DNA]] dari cetakan [[mRNA]] dengan bantuan [[primer]] oligo dT yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA.<ref name="Allison"/> Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan [[ribonuklease]] atau larutan basa.<ref name="Allison"/> Terdapat 2 enzim yang berperan dalam proses sintesis cDNA, yaitu enzim [[DNA polimerase I]] (Klenow fragment) dan S1 [[nuklease]].<ref name="Allison"/> ▲Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah [[degradasi\|terdegradasi]], selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat [[permanen]].<ref name="Farrell">{{en}} Farrell RE. 2010. RNA Methodologies: Laboratory Guide for Isolation and Characterization. London: Elsevier.</ref> cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai ~~vector~~vektor [[kloning]] seperti [[plasmid]], [[kosmid]], dan [[bakteriofage]], dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA ~~genomic~~genomik yang kompleks.<ref name="Farrell"/> Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ ~~sekuens~~[[sekuen]] yang terekspresi ([[ekson]]) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon.<ref (name="Farrell ~~2010).~~"/> == Aplikasi == Isolasi RNA dan sintesis cDNA dapat juga digunakan untuk kloning suatu gen karena biasanya gen yang dikloning merupakan urutan DNA tanpa [[intron]], gen ini yang menyandikan sifat tertentu ke tanaman lain untuk membuat [[tanaman transgenik]] atau dapat pula kloning gen penyandi [[protein]] atau [[enzim]] tertentu pada tanaman ke [[bakteri]] atau [[vektor]] lainnya seperti [[khamir]] atau biakan sel sehingga produksinya dapat meningkat sesuai dengan kebutuhan yang diinginkan.<ref name="Purwati">Purwati RD, Sulistyowati L. 2012. Transfer gen β-1,3-Glucanase dari jamur Trichoderma asperillum pada kalus abaka untuk ketahanan terhadap penyakit layu Fusarium. Jurnal Litri 18(1): 24-30.</ref> Contohnya dalam pembuatan tanaman transgenik [[Abaka]] yang tahan terhadap serangan [[cendawan]] [[Fusarium]] dengan menyandikan [[gen]] [[beta-1,3 glukanase]] yang diambil dari cendawan lain yaitu [[Trichoderma asperillum]].<ref name="Purwati"/> Aplikasi lainnya, cDNA ini digunakan sebagai [[kofaktor]] untuk [[HIV-1]] berfusi dan masuk kedalam sel manusia.<ref name="Yu">{{en}}Yu Feng, Christopher C. Broder, Paul E. Kennedy, and Edward A. Berger. 2011. HIV-1 Entry Cofactor: Functional cDNA Cloning of a Seven-Transmembrane, G Protein–Coupled Receptor.J Immunol. Jun 1, 2011; 186(11): 6076–6081.</ref> [[Rekombinan]] cDNA ini menghambat ekspresi dari [[CD-4]] untuk [[memediasi]] HIV-1 untuk masuk dan [[menginfeksi]] sel manusia.<ref name="Yu"/> Aplikasi ini sangat membantu dalam perkembangan di bidang [[medis]], terutama untuk penyakit yang belum dapat ditemukan cara penanganannya.<ref name="Walker">{{en}}John M. Walker,Ralph Rapley. 2005. Medical BioMethods Handbook. New Jersey: Humana.</ref> Walaupun metode ini belum dapat mengobati, namun metode ini dapat menghambat ekspresi dan infeksi dari penyakit tersebut.<ref name="Walker"/> == Pranala luar == Baris 15 ⟶ 24: * [http://fantom.gsc.riken.jp/ Pusat data genomika fungsional pada tikus] == Referensi == ~~{{Genetika-stub}}~~ {{reflist}} {{Asam nukleat}} {{Authority control}} [[Kategori:DNA]]