|
#ALIH [[Pengurutan DNA]]
'''Sekuensing asam nukleat''' atau '''pengurutan asam nukleat''' adalah proses penentuan urutan [[nukleotida]] pada suatu fragmen [[DNA]] atau [[RNA]].
==Kegunaan sekuensing asam nukleat==
Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi [[makhluk hidup]] untuk melangsungkan hidup dan [[reproduksi|berkembang biak]]. Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA dapat berguna dalam penelitian [[biologi]] manapun. Sebagai contoh, dalam [[ilmu pengobatan]] sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan [[penyakit genetik]]. Demikian pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit ([[patogen]]) dapat membuka jalan bagi pengobatan [[penyakit menular]]. [[Bioteknologi]], yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna.
Karena RNA dibentuk dengan [[transkripsi]] dari DNA, informasi yang dikandung RNA juga terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup untuk membaca informasi pada RNA. Namun demikian, sekuensing [[RNA]] dibutuhkan khususnya pada [[eukaryota]], karena molekul RNA eukaryot tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena pemotongan [[intron]] setelah proses [[transkripsi]].
==Sekuensing DNA==
Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan ''metode terminasi rantai'' yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya [http://www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?artid=431765]. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA ''in vitro'' yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.
===Metode Sanger===
[[Image:Sequencing.jpg|thumb|right|Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.]]Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut ''primer'' yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. ''Primer'' tersebut diperpanjang menggunakan [[DNA polimerase]], enzim yang me[[replikasi]] DNA. Bersama dengan ''primer'' dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa [[deoksinukleotida]] (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (''terminator'' rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya '''di-'''deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan [[elektroforesis gel poliakrilamida]], atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi dengan polimer kental.
Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing.
====Metode Sanger asli====
Pada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai (''labelling'') ''primer'' yang digunakan dengan [[fosfor]] [[radioaktif]] sebelum reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian di[[elektroforesis]] pada empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.<br>
Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam ''primer'' yang ditandai dengan pewarna [[fluoresensi|berpendar]] (''fluorescent dye''). Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan bahan [[radioaktif]]; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal sebagai metode ''dye primer sequencing''.
====Sekuensing ''dye terminator''====
[[Image:Sanger_sequencing_read_display.gif|thumb|400px|right|Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metode ''dye terminator''.]]
Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensing ''dye terminator''. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan ''primer'' berlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar pada [[panjang gelombang]] yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaan ''primer'' berwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (''peak'') yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan. <br> Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah. ''Primer-primer'' yang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk ''primer'' yang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan ''universal primer''.
====Automatisasi dan penyiapan sampel====
Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel berlabel fluoresens sekaligus dalam sekali ''batch'' (elektroforesis) yang dapat dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan ulang dalam [[larutan penyangga]] yang sesuai harus dilakukan secara terpisah.
Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode "sekuensing daur" (''cycle sequencing'') paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelan ''primer'' (''primer annealing''), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau ''melting'') untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu seperti ''hairpin loop'' atau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (''thermal cycler'') [[PCR]]. Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95°C).
===Metode Maxam-Gilbert===
Pada waktu yang kira-kira hampir bersamaan dengan dikenalkannya metode sekuensing Sanger, Maxam dan Gilbert mengembangkan metode sekuensing DNA yang didasarkan pada modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA [http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521].
Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan [[kloning]] untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam ''scale-up''.
<!--
===Other DNA sequencing methods===
Other sequencing techniques which are under development, and may offer benefits over the conventional methods, include:
* [[Sequencing by Hybridization]]
* [[Pyrosequencing]]
* [[nanopore sequencing]]
-->
===Sekuensing DNA skala besar===
Metode sekuensing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong pendek DNA sekaligus. Contohnya, mesin sekuensing modern yang menggunakan metode Sanger hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap sekuensing [http://www.appliedbiosystems.com/catalog/myab/StoreCatalog/products/CategoryDetails.jsp?hierarchyID=102&category1st=a50&category2nd=a51&category3rd=111907]. Keterbatasan ini disebabkan oleh [[probabilitas]] terminasi rantai yang menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.
Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali dibutuhkan. Sebagai contoh, [[genom]] [[bakteri]] sederhana dapat mengandung jutaan pasang basa, sedangkan [[genom manusia]] terdiri atas lebih dari 3 milyar pasang basa. Berbagai strategi telah dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk strategi ''[[:en:primer walking|primer walking]]'' dan ''[[:en:shotgun sequencing|shotgun sequencing]]''. Kedua strategi tersebut melibatkan ''pembacaan'' banyak bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya menyusun hasil pembacaan tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai contoh, metode ''shotgun sequencing'' merupakan metode yang paling praktis untuk sekuensing genom ukuran besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan.
Data sekuens bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi. Hal ini dapat dilakukan dengan metode [[reaksi rantai polimerase]] bila ''primer'' yang dibutuhkan untuk mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat. Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel menggunakan vektor bakteri, yaitu memanfaatkan bakteri untuk "menumbuhkan" salinan DNA yang diinginkan sebanyak beberapa ribu pasang basa sekaligus. Biasanya proyek-proyek sekuensing DNA skala besar memiliki persediaan ''pustaka'' hasil kloning semacam itu.
==Sekuensing RNA==
[[RNA]] lebih tidak stabil daripada DNA di dalam sel dan lebih rentan terhadap penguraian oleh enzim [[nuklease]] secara laboratorium. Seperti yang telah disebutkan di atas, kadang kala sekuensing RNA diperlukan walaupun informasi yang dikandung [[RNA]] sudah terdapat di dalam [[DNA]], khususnya pada [[eukaryota]]. Dalam sekuensing RNA, metode yang umum digunakan adalah mula-mula membentuk fragmen DNA dari RNA tersebut dengan enzim [[transkriptase balik]]. Misalnya, DNA dapat disintesis dari cetakan [[mRNA]] dan disebut sebagai [[DNA komplementer]] (cDNA). Fragmen DNA tersebut kemudian dapat disekuensing dengan cara-cara seperti yang disebutkan di atas.
==Lihat pula==
* [[Sandi genetik]]
* [[Reaksi rantai polimerase]]
* [[Proyek Genom Manusia]].
==Pranala luar==
*{{en}} [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Genome Informasi mengenai proyek genom berbagai organisme dan data yang dihasilkan] di National Center for Biotechnology Information, A.S.
*{{en}} (2005) [http://www.plosbiology.org/plosonline/?request=get-document&doi=10.1371%2Fjournal.pbio.0030025 Genome Sequencing: Using Models to Predict Who's Next.] PLoS Biol 3(1): e25.
[[Kategori:Biologi molekular]]
[[de:DNA-Sequenzierung]]
| 