Pengurutan DNA: Perbedaan antara revisi

Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan [[kloning]] untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam ''scale-up''.

 

Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan ''metode terminasi rantai'' yang dikembangkan oleh [[Frederick Sanger]] dan rekan-rekannya [http://www.pubmedcentral.gov/articlerender.fcgi?artid=431765]. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA ''in vitro'' yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.

 

 

==== Sekuensing ''dye terminator'' ====

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensing ''dye terminator''. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan ''primer'' berlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar pada [[panjang gelombang]] yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaan ''primer'' berwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (''peak'') yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan. {{br}} Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah. ''Primer-primer'' yang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk ''primer'' yang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan ''universal primer''.

 

==== Illumina(Solexa) ====

Metode sekuensing ini ditemukan oleh perusahaan Illumina. Sekuensing Illumina menggunakan primer yang akan berkomplemen dengan adaptor yang telah disediakan oleh perusahaan pada sebuah plat. Proses sekuensing ini menggunakan teknik ''bridge PCR'', yaitu terbentuknya jembatan pada saat elongasi. Nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens akan direkam oleh kamera.<ref name="satu">{{en}} Nejad AM, Narimani Z, Hosseinkhan N. 2013. ''Next Generation Sequencing and Sequence Assembly''. New York: Springer </ref>

 

== Sekuensing DNA skala besar ==