Amplifikasi Acak Polimorfisme DNA: Perbedaan antara revisi

'''Amplifikasi Acak Polimorfisme DNA''' merupakan satu jenis [[penanda genetik|penanda molekular]] yang banyak dipakai dalam [[penelitian]] dan diagnostik [[biologi molekular]]. Penanda ini lebih dikenal sebagai '''RAPD''' (biasa dipanggil ''rapid''), singkatan dari '''''Random Amplification of Polymorphic DNA'''''.<ref name=rvc>{{en}} [RVC]. 2004. Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD). [terhubung berkala]http://www.rvc.ac.uk/review/dna_1/5_RAPD.cfm [15 Mei 2010].</ref> Sebagai penanda genetik, RAPD dikenal sebagai penanda yang relatif murah dan tidak memerlukan keterampilan teknis yang tinggi.<ref name=rvc/> Penanda ini bersifat ''[[tindak genetik|dominan]]'', dalam arti, ia dapat membedakan kelas genotipe [[tindak genetik|resesif]] dari kelas-kelas genotipe yang lain.<ref name=rvc/> RAPD memerlukan teknik [[PCR]] dan [[elektroforesis gel]] dalam penerapannya.<ref name=mac>{{en}} Macgowan AP. 1993. DNA (RAPD) analysis. [terhubungberkala] http://jmm.sgmjournals.org/cgi/reprint/38/5/322.pdf [15 Mei 2010].</ref> Kelemahan RAPD yang sangat dikenal adalah dapat memberikan hasil yang berbeda-beda apabila diulang, sehingga dianggap kurang handal (''reliable''), khususnya bagi keperluan diagnostik, seperti [[sidik jari DNA]].<ref name=mac/>

RAPD (''Random Amplified Polymorphic DNA'') merupakan metode perbanyakan genom yang paling sering digunakan karena sangat mudah dan membutuhkan jumlah DNA genom yang tidak terlalu banyak.<ref name=wil/> Metode dasarnya hampir sama seperti PCR, tetapi fragmen genom yang diperbanyak bersifat acak dengan satu atau banyak primer pada arbitrary sequence (sekuens tidak tentu).<ref name=mic/> Polimorfisme yang terjadi antara individual atau strain dikenali melalui perbedaan pada fragmen DNA yang diperbanyak oleh primer yang tersedia.<ref name=mic>{{en}} Micheli MR, Bova R, Pascale E, D’Ambrosio E. 1994. Reproducible DNA fingerprinting with the random and polymorphic DNA (RAPD) method. ''Nucleic Acid Research'' 22 (10) : 1921-22.</ref>

RAPD memerlukan pasangan [[primer]], biasanya berukuran antara 8-mer hingga 12-mer (lihat [[oligo]]), karena menggunakan teknik PCR. Setiap pasangan primer akan menghasilkan sejumlah pita (''band'') yang akan tampak pada hasil elektroforesis gel.<ref name=mbw>{{en}} Mbwana J, ''et al''. 2006. Molecular characterization of Haemophilus ducreyi isolates from different geographical locations. ''J Clin Microbiol'' 44(1):132-7</ref> Pasangan [[primer (genetika)|primer]] yang dipilih (bisa sudah diketahui atau dipilih beberapa secara acak) diberikan pada sampel-sampel [[DNA]] (disebut '' DNA templat'') yang sudah dipersiapkan., Selanjutnyaselanjutnya PCR dijalankan.<ref name=wil/> Sewaktu proses PCR, primer akan menempel pada urutan-urutan basa yang komplemen pada DNA templat.<ref name=wil/> Di akhir PCR akan terdapat sejumlah besar fragmen-fragmen pendek DNA hasil amplifikasi.<ref name=wil/> Apabila terdapat [[delesi]] untuk suatu lokasi templat, akan terjadi polimorfisme.<ref name=wil/> Dengan elektroforesis gel, akan terlihat pita yang terputus-putus apabila terdapat polimorfisme (oleh karena itu bersifat dominan).<ref name=wil>{{en}} Williams JG, ''et al''. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. ''Nucleic Acids Res''. 1990 Nov 25;18(22):6531-5.</ref>

Metode RAPD memberikan kemudahan mereplikasi DNA yang tidak diketahui sekuensnya dan dalam konsentrasi yang kecil (nanogram) dengan primer-primer yang bersifat tidak tentu (''arbitrary primers'').<ref name=bardakci/> Teknik RAPD yang umum dipakai memerlukan oligonukleotida sintesis pendek, berukuran sekitar 10 basa dari sekuens acak.<ref name=bardakci/> Primer ini biasanya telah disiapkan dalam bentuk kit untuk analisis RAPD.<ref name=bardakci/> Jika primer yang dipakai berukuran kurang dari 10 basa maka lebih cocok digunakan untuk menampilkan riwayat sidik jari DNA yang lebih kompleks (bidang forensik) dengan situs penempelan primer pada sekuens DNA yang lebih banyak.<ref name=bardakci/> Perlu diperhatikan bahwa panjang primer menjadi faktor penentu berhasil tidaknya replikasi. Primer spesifik yang ideal berukuran tidak lebih panjang dari 15 bp.<ref name=bardakci>{{en}} Bardakci V. 2001. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. ''Turk J Biol'' 25:185-96.</ref>

Primer yang panjang akan menyebabkan peluang komplemen dengan utas DNA semakin kecil, bahkan nihil.<ref name=chantlercha>{{en}} Chantler P. 2004. Recombinant DNA. [terhubung berkala]. http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/5_RAPD.cfm [4 Mei 2009]. </ref>

Setelah dilakukan sintesis primer, tahapan selanjutnya adalah mereaksikan RAPD dalam DNA thermal cycler, yaitu suatu perangkat PCR untuk menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat.<ref name=nuc/> Reaksi ini bertujuan untuk mengamplifikasi (mereplikasi) fragmen-fragmen DNA (amplikon) dengan riwayat khusus. Amplifikasi ini meliputi 3 tahapan besar, yakni denaturasi DNA 96oC96^oC selama 1 menit, annealing 40oC40^oC selama 1 menit, dan ekstensi 72oC72^oC selama 2 menit.<ref name=nuc/> Saat annealing, homologi sekuens antara primer dan utas DNA turut berperan menentukan keberhasilan reaksi.<ref name=nuc/> Tahapan-tahapan yang ada akan berulang sebanyak 40 siklus hingga diperoleh sejumlah produk amplikon yang memiliki sekuens acak.<ref name=nuc>{{en}} Nuchprayoon S, Junpee A, Poovorawan Y. 2007. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) for differentiation between Thai and Myanmar strains of Wuchereria bancrofti. ''Filaria J'' 6:6.</ref>

Adanya variasi urutan nukleotida yang diakibatkan insersi atau delesi pada beberapa lokus gen nantinya akan dianggap sebagai polimorfisme yang menjadi penanda diversitas genetik suatu galur (breed).<ref name=chantlercha/> Hal ini dapat dilihat setelah divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa.<ref name=cha/> Keberadaan profil DNA unik antar lokus gen akan terlihat berupa pita terang setelah pewarnaan gel dengan EtBr yang dilihat di bawah pendaran sinar UV.<ref name=bardakci/>