Revisi per 13 April 2014 14.06 sunting BP60Fita (bicara \| kontrib) 490 suntingan Tidak ada ringkasan suntingan Tag: BP2014 ← Revisi sebelumnya		Revisi per 14 April 2014 01.11 sunting balikkan BP60Fita (bicara \| kontrib) 490 suntingan Tidak ada ringkasan suntingan Tag: BP2014 Revisi selanjutnya →
Baris 7: Dalam mensintesis cDNA total, diperlukan mRNA total sebagai cetakan<ref name="Allison"/>. mRNA [[eukariot]] umumnya memiliki ujung 3’ yang telah mengalami [[poliadenilasi]] sehingga membentuk poly(A) tail, sedangkan tipe RNA lain seperti [[rRNA]] dan [[tRNA]] tidak memiliki bagian tersebut<ref name="Allison"/>. Poli A pada ujung 3’ mRNA penting dalam proses purifikasi mRNA dari ekstrak total RNA tipe sel spesifik dan umumnya purifikasi dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi afinitas<ref name="Allison"/>. Setelah didapatkan mRNA murni, terdapat beberapa tahap dalam mensintesis cDNA total, tahap pertama adalah sintesis pita/ untaian pertama cDNA ~~(first strand synthesis of cDNA)~~. Dalam tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari template mRNA dengan bantuan primer oligo (dT) yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA. Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa. Tahapan kedua adalah sintesis pita/ untaian kedua cDNA ~~(second strand synthesis of cDNA). Tahapan~~ ini menggunakan metode self-priming yaitu menggunakan primer yang berasal dari dirinya sendiri. Terdapat 2 enzim yang berperan, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow fragment) dan S1 nuklease. Enzim DNA polymerase I merupakan enzim yang memiliki aktivitas 5’ – 3’ polymerase dan 3’ – 5’ eksonuklease, enzim ini akan mensintesis second strand dari ujung 3’ menggunakan hairpin yang terbentuk secara alami dari first strand sebagai primer, kemudian hairpin tersebut akan dipotong menggunakan S1 nuklease, sehingga menghasilkan cDNA beruntai ganda (Allison 2007). Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah terdegradasi, selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat permanen. cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai vector kloning seperti plasmid, kosmid, dan bakteriofage, dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA genomic yang kompleks. Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ sekuens yang terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon (Farrell 2010).

DNA komplemen: Perbedaan antara revisi