Isolasi DNA: Perbedaan antara revisi
Konten dihapus Konten ditambahkan
Tidak ada ringkasan suntingan Tag: BP2014 |
Tidak ada ringkasan suntingan Tag: BP2014 |
||
Baris 1:
==Sejarah==
Isolasi [[DNA]] pertama kali dilakukan oleh ilmuwan asal [[Swiss]] bernama [[Friedrich Miescher]] pada tahun 1869.<ref name="Shmaefsky"/> Ia menemukan senyawa asam yang mengandung nitrogen dan fosfat pada [[inti sel]] dari [[sel darah putih]].<ref name="Shmaefsky"/> Senyawa ini diberi nama ''nuklein'', namun pada tahun 1889 muridnya yaitu [[Richard Altmann]] menamainya ''[[asam nukleat]]''.<ref name="Shmaefsky"/> Metode yang digunakan oleh Miescher adalah ''[[alkalyne lysis]]'' untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA. <ref name="Shmaefsky">Shmaefsky BR. 2006. ''Biotechnology 101''. Westport : Greenwood.</ref>
==Metode==
===Isolasi DNA Kromosom===
Metode ini adalah contoh metode ''alkalyne lysis''. Isolasi [[kromosom]] [[bakteri]] dimulai dengan meng[[inokulasi]] [[biakan]] pada media ''[[Luria Broth]]'' dengan kondisi 37 °C selama 18 jam, lalu suspensi bakteri disentrifugasi pada 8000 rpm selama 2 menit. Kemudian [[supernatan]] dibuang hingga bersih dan pelet diresuspensi dengan penambahan 400 µL [[bufer Tris-EDTA]] 1X. Suspensi bakteri ditambahkan dengan 100 µL [[lisozim]] 50 mg/mL, selanjutnya diinkubasi dengan kondisi 37 °C selama 1 jam dan setiap 15 menit tabung di-flip. Lalu suspensi bakteri ditambahkan dengan 150 µL SDS 10% dan di-flip, serta ditambahkan 10 µL [[Proteinase K]] 10 mg/mL. Selanjutnya suspensi bakteri diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam dan setiap 15 menit tabung di-flip. Ke dalam suspensi ditambahkan 100 µL NaCl 5 M dan 100 µL [[CTAB]] 10% untuk mengikat protein sehingga DNA terpisah dari protein, kemudian tabung di-flip.<ref name="Brown"/> Suspensi diinkubasi dengan kondisi 65 °C selama 20 menit, dan ditambahkan 200 µL P:C:I yang terdiri dari phenol yang berfungsi untuk degradasi protein.<ref name="Basu & Johnson">Basu P, Johnson M. 2009. ''The Integrated Approach to Chemistry Laboratory: Selected Experiments''. Pennsylvania : DEStech.</ref> Dan juga terdiri dari [[kloroform]] untuk degradasi [[lemak]], dan isoamil alkohol sebagai anti buih.<ref name="Brown"/> Lalu dibolak-balik. Kemudian suspensi disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 500 µL lapisan atas diambil dan dipindahkan ke tabung baru, lalu sebanyak 500 µL C:I ditambahkan ke tabung baru. Suspensi kembali disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, dan lapisan atas sebanyak 300 µL diambil dan dipindahkan ke tabung baru. Selanjutnya isopropanol dingin sebanyak 300 µL ditambahkan ke tabung baru tersebut. Suspensi diinkubasi dengan kondisi -20 oC selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit. Lalu pelet ditambahkan dengan 700 µL etanol 70% kemudian di-spin selama 10 detik. Etanol dibuang dan tabung dikeringkan dalam inkubator dengan kondisi 37 °C, dan pelet diresuspensi dengan 50 µL ddH2O kemudian diinkubasi dengan kondisi 37 °C. <ref name="Brown">Brown TA. 2013. ''Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction''. Hoboken : John Wiley & Sons.</ref>
===Isolasi DNA Plasmid===
Sebanyak 1,5 mL garam fisiologis untuk menjaga tekanan isotonis dimasukkan ke [[tabung mikro]] lalu biakan sebanyak setengah cawan bakteri diambil dan dilakukan pengadukan.<ref name="Sircar">Sircar S. 2008. ''Principles of Medical Physiology''. New York : Thieme.</ref> Tabung mikro disentrifugasi 6000 rpm selama 2 menit.<ref name="Brown"/> Supernatan dibuang dari pelet. Pelet diresuspensi dengan 250 μL larutan A yang terdiri dari Tris-Cl sebagai pengatur pH, glukosa sebagai penjaga tekanan isotonis, dan EDTA sebagai chelating agent dingin.<ref name="Brown"/> Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.<ref name="Sircar"/> Lalu larutan B yang terdiri dari NaOH sebagai pendenaturasi DNA dan SDS sebagai pelarut membran sel sebanyak 250 μL ditambahkan, dan tabung mikro dibolak balik 5 kali, lalu diinkubasi baki es selama 10 menit.<ref name="Sircar"/> Larutan C dingin yang terdiri dari kalium asetat dan asam asetat yang berfungsi untuk merenaturasi DNA sebanyak 250 μL ditambahkan ke campuran, kemudian dibolak balik 5 kali, lalu diinkubasi 5 menit tepat di baki es.<ref name="Sircar"/> Selanjutnya tabung mikro disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit.<ref name="Sircar"/> Lalu supernatan sebanyak 600 μL dipindahkan ke tabung mikro steril baru.<ref name="Sircar"/> P:C:I yang terdiri dari phenol yang berfungsi untuk degradasi protein, kloroform untuk degradasi lemak, dan isoamil alkohol sebagai anti buih sebanyak 500 μL ditambahkan ke campuran, lalu dibolak balik 5 kali, lalu disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit.<ref name="Basu & Johnson"/> Supernatan sebanyak 400 μL dipindahkan ke tabung mikro steril baru, lalu etanol 96% untuk mengikat air sehingga DNA mengendap sebanyak 1 mL ditambahkan.<ref name="Basu & Johnson"/> Suspensi diinkubasi freezer -20 °C, lalu disentrifugasi 10.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dengan segera, lalu etanol 70% untuk mencuci DNA sebanyak 700 μL ditambahkan.<ref name="Basu & Johnson"/> Tabung mikro disentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit, lalu supernatan segera dibuang.<ref name="Chaitanya"/> Tabung mikro dikeringkan pada inkubator 37 oC hingga etanol 70% kering. TE atau ddH2O steril sebanyak 30 μL ditambahkan ke tabung mikro. <ref name="Chaitanya">Chaitanya KV. 2013. CELL AND MOLECULAR BIOLOGY: A Lab Manual. Delhi : PHI.</ref>
= Rujukan =
| |||