Elektroforesis dua dimensi
Elektroforesis dua dimensi (2-DE atau elektroforesis 2-D) adalah suatu teknik analisa protein dengan melakukan pemisahan protein menggunakan dua dimensi.[1] Teknik ini sering digunakan untuk studi proteomika (analisa molekular terhadap keseluruhan protein yang dihasilkan dari ekspresi gen dalam sel), deteksi marker penyakit, penelitian kanker dan obat, pemeriksaan kemurnian, dan juga purifikasi (pemurnian) protein skala mikro.[2] Hal ini dikarenakan, elektroforesis 2-D mampu memisahkan hingga ribuan protein secara bersamaan.[3]
Prinsip dasar
Dalam elektroforesis 2-D, dimensi pertama dalam pemisahan protein dilakukan berdasarkan titik isoelektrik (atau muatan) protein tersebut. Sedangkan, pada dimensi kedua, protein akan dipisahkan berdasarkan berat molekulernya. Pemisahan protein dengan teknik ini dilakukan dalam kondisi terdenaturasi.[1]
Pada dimensi pertama, protein yang akan dianalisa dilarutkan dalam urea untuk memutuskan ikatan hidrogen pada protein (agen pendenaturasi). Urea umum digunakan karena senyawa ini tidak merubah dalam muatan protein sehingga pemisahan protein dapat dilakukan berdasarkan muatannya. Dengan menggunakan medan listrik, protein dipisahkan melalui gel yang memiliki gradien pH. Protein akan bergerak hingga berhenti pada titik dimana muatan protein tersebut netral (titik isoelektriknya).[1]
Setelah melalui dimensi pertama, protein dipisahkan kembali melalui dimensi kedua. Biasanya tahap ini dilakukan dengan gel poliakrilamida dan sodium dodesil sulfat (SDS). SDS akan membuat seluruh protein bermuatan negatif sehingga pemisahan bisa dilakukan hanya berdasarkan bobot molekulernya.[1]
Teknik elektroforesis 2-D yang sering digunakan adalah: untuk dimensi pertama dapat menggunakan elektroforesis pemfokusan isoelektrik (isoelectric focusing, IEF) dan nonequilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE). Sedangkan untuk dimensi kedua, biasanya digunakan elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS-PAGE).[1]
Visualisasi dan Evaluasi Hasil
Untuk melihat hasil pemisahan protein menggunakan elektroforesis 2-D, dapat dilakukan pewarnaan gel dengan coomasie atau pewarnaan perak. Teknik visualisasi lain yang dapat digunakan adalah fluorografi dan autoradiografi (penggunaan radioaktif). Di dalam satu gel, bisa terdapat ribuan titik protein yang dapat dianalisa atau diambil (dipisahkan) menggunakan perangkat lunak (sofware) tertentu. Setelah dilakukan pemilihan dan pemisahan protein (berupa titik pada gel), analisa lebih lanjut biasanya dilakukan dengan melakukan digesti protein dan kemudian melalui tahap analisa menggunakan spektofotometer massa (MALDI-TOF).
Referensi
- ^ a b c d e (Inggris)Thierry Rabilloud (1999). Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice). Springer. ISBN 978-3-540-65792-7.
- ^ (Inggris)Andrew J. Link (1999). 2-D Proteome Analysis Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press. ISBN 978-0-89603-524-9.
- ^ 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients: Principles and Methods