DNA komplemen

DNA komplemen, atau jauh lebih dikenal dengan singkatannya cDNA (dari complementary DNA), merupakan DNA berkas tunggal (single-stranded) sintetik/buatan yang disalin dari berkas RNA menggunakan teknik PCR dan memanfaatkan enzim reverse transcriptase. Penggunaan cDNA sangat luas, terutama dalam analisis ekspresi genetik dan transkriptomika. RNA berkas tunggal atau transkriptom bersifat tidak stabil karena mudah dicerna dan dilebur dalam sel. Pengubahan RNA berkas tunggal menjadi cDNA membuatnya lebih mudah dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur).

Sintesis

sintesis cDNA untai pertama diperlukan untuk menstabilkan mRNA yang didapatkan. Hal ini dilakukan dengan mengunakan enzim reverse transcriptase dan primer oligo dT yang akan menempel pada daerah poli A tail yang merupakan ciri khas dari mRNA sehingga semua mRNA akan ditranskrip menjadi cDNA untai pertama sehingga selanjutnya dapat dilakukan PCR kembali untuk mencari cDNA yang diingikan. Dalam mensintesis cDNA total, diperlukan mRNA total sebagai template. mRNA eukariotik umumnya memiliki ujung 3’ yang telah mengalami poliadenilasi sehingga membentuk poly(A) tail, sedangkan tipe RNA lain seperti rRNA dan tRNA tidak memiliki bagian tersebut. Poli A pada ujung 3’ mRNA penting dalam proses purifikasi mRNA dari ekstrak total RNA tipe sel spesifik dan umumnya purifikasi dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi afinitas (Allison 2007).

Setelah didapatkan mRNA murni, terdapat beberapa tahap dalam mensintesis cDNA total, tahap pertama adalah sintesis pita/ untaian pertama cDNA (first strand synthesis of cDNA). Dalam tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari template mRNA dengan bantuan primer oligo (dT) yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA. Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa. Tahapan kedua adalah sintesis pita/ untaian kedua cDNA (second strand synthesis of cDNA). Tahapan ini menggunakan metode self-priming yaitu menggunakan primer yang berasal dari dirinya sendiri. Terdapat 2 enzim yang berperan, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow fragment) dan S1 nuklease. Enzim DNA polymerase I merupakan enzim yang memiliki aktivitas 5’ – 3’ polymerase dan 3’ – 5’ eksonuklease, enzim ini akan mensintesis second strand dari ujung 3’ menggunakan hairpin yang terbentuk secara alami dari first strand sebagai primer, kemudian hairpin tersebut akan dipotong menggunakan S1 nuklease, sehingga menghasilkan cDNA beruntai ganda (Allison 2007).

Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah terdegradasi, selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat permanen. cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai vector kloning seperti plasmid, kosmid, dan bakteriofage, dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA genomic yang kompleks. Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ sekuens yang terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon (Farrell 2010).

Pranala luar

• (Inggris) Animasi cDNA
• (Inggris) H-Invitational Database, suatu pusat data DNA dan transkriptom manusia
• Pusat data genomika fungsional pada tikus