Blot Southern
Blot Southern merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.[1] Metode ini diambil dari nama penemunya yaitu Edward M. Southern.[1] Prinsipnya adalah kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran.[1] Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran.[1] Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah membran nitroselulosa.[2]
Sejarah
Blot Southern merupakan sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA.[1] Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh.[3]
Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi dengan probe.[3] Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe).[3] DNA dipisahkan terlebih dahulu dengan elektroforesis.[3] Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang diinginkan.[3] Blot Southern mendeteksi DNA rantai tunggal dengan menggunakan DNA sebagai pelacak.[3] Selain Blot Southern, metode lain yang mirip dan dikembangkan dari Blot Southern adalah Blot Western, Blot Northern, dan Blot Southwestern yang memiliki prinsip yang sama, namun molekul yang akan dideteksi dan pelacak yang digunakan berbeda.[1] Kegunaan dari Blot Southern adalah untuk menganalisis keberadaan mutan yang ada pada suatu organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang menjadi mutan pada organisme tersebut.[3]
Tahapan
Tahap awal dari metode Blot Southern adalah pendigestian DNA dengan enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.[4] Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan tahap blotting.[4] Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa.[4] Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum, membran diletakkan pada bagian bawah gel.[4] Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran.[4] Proses transfer berlangsung dengan memanfaatkan daya kapilaritas.[4] setalah DNA ditransfer ke gel, membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran.[4] Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif, tetapi dapat juga digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar.[4] Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi.[4] Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran.[4] Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran.[4] Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi.[4]
Aplikasi
Teknik Blot Southern telah digunakan dalam berbagai aplikasi di bidang kesehatan maupun pada rekayasa genetika.[5] Salah satunya digunakan untuk menganalisis sistem major histokompatibilitas pada tikus dan menganalisis penyusunan klon dari gen T-cell receptor penyakit luka yang diakibatkan oleh mikosis dari fungoides.[5][6]
Lihat pula
- Blot Western—metode dengan prinsip serupa untuk mendeteksi protein
Referensi
- ^ a b c d e f (Inggris) Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2004. Molecular Biology of The Gene 5th ed. San Fransisco : Benjamin Cummings. Hal. 77-85.
- ^ (Inggris) Zuppaedo AB, Siebeling RJ. 1998. An Epimerase Gene Essential for Capsule Synthesis in Vibrio vulnificus. Infect Immun 66(6): 2601–2606.
- ^ a b c d e f g (Inggris)Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98:503-517.
- ^ a b c d e f g h i j k l (Inggris) [MolecularStation]. 2008. Southern blot. [terhubung berkala] http://www.molecularstation.com/dna/southern-blot/ [22 Mei 2009].
- ^ a b (Inggris) Gunther E, Wurst W, Wonigeit K, Epplen JT. Analysis of the rat major histocompatibility system by Southern blot hybridization. J Immunol 143(2);1257-1261.
- ^ (Inggris) Dosaka N, Tanaka T, Fujita M, Miyachi Y, Horio T, Imamura S. 1989. Southern blot analysis of clonal rearrangement of T-cell receptor gene in plaque lesion of mycosis fungoides. J Invest Dermatology 93;626-629.