DNA komplemen
Artikel ini merupakan artikel yang dikerjakan oleh Peserta Kompetisi Menulis Bebaskan Pengetahuan 2014 yakni BP60Fita (bicara). Untuk sementara waktu (hingga 26 April 2014), guna menghindari konflik penyuntingan, dimohon jangan melakukan penyuntingan selama pesan ini ditampilkan selain oleh Peserta dan Panitia. Peserta kompetisi harap menghapus tag ini jika artikel telah selesai ditulis atau dapat dihapus siapa saja jika kompetisi telah berakhir. Tag ini diberikan pada 9 April 2014. Halaman ini terakhir disunting oleh BP60Fita (Kontrib • Log) 3900 hari 955 menit lalu. |
DNA komplemen, atau jauh lebih dikenal dengan singkatannya cDNA (dari complementary DNA), merupakan DNA berkas tunggal (single-stranded) sintetik/buatan yang disalin dari berkas RNA menggunakan teknik PCR dan memanfaatkan enzim reverse transcriptase[1]. Penggunaan cDNA sangat luas, terutama dalam analisis ekspresi genetik dan transkriptomika[1]. RNA berkas tunggal atau transkriptom bersifat tidak stabil karena mudah dicerna dan dilebur dalam sel[1]. Pengubahan RNA berkas tunggal menjadi cDNA membuatnya lebih mudah dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur)[1].
Sintesis
Sintesis cDNA ini dilakukan dengan mengunakan enzim "reverse transcriptase dan primer oligo dT yang akan menempel pada daerah ekor poli A yang merupakan ciri khas dari mRNA sehingga semua mRNA akan ditranskrip menjadi cDNA untai pertama sehingga selanjutnya dapat dilakukan PCR untuk pengecekan[1].
Dalam mensintesis cDNA total, diperlukan mRNA total sebagai cetakan[1]. mRNA eukariot umumnya memiliki ujung 3’ yang telah mengalami poliadenilasi sehingga membentuk poly(A) tail, sedangkan tipe RNA lain seperti rRNA dan tRNA tidak memiliki bagian tersebut[1]. Poli A pada ujung 3’ mRNA penting dalam proses purifikasi mRNA dari ekstrak total RNA tipe sel spesifik dan umumnya purifikasi dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi afinitas[1].
Setelah didapatkan mRNA murni, terdapat beberapa tahap dalam mensintesis cDNA total, tahap pertama adalah sintesis pita/ untaian pertama cDNA[1]. Dalam tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari cetakan mRNA dengan bantuan primer oligo dT yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA[1]. Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa[1]. Tahapan selanjutnya adalah sintesis pita/ untaian kedua cDNA ini menggunakan primer yang berasal dari dirinya sendiri[1]. Terdapat 2 enzim yang berperan, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow fragment) dan S1 nuklease[1]. Enzim DNA polymerase I merupakan enzim yang memiliki aktivitas 5’ – 3’ polymerase dan 3’ – 5’ eksonuklease, enzim ini akan mensintesis untaian kedua dari ujung 3’ menggunakan tikungan terminasi (hairpin) yang terbentuk secara alami dari untaian pertama sebagai primer, kemudian hairpin tersebut akan dipotong menggunakan S1 nuklease, sehingga menghasilkan cDNA beruntai ganda [1].
Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah terdegradasi, selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat permanen[2]. cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai vektor kloning seperti plasmid, kosmid, dan bakteriofage, dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA genomik yang kompleks[2]. Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ sekuen yang terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon[2].