DNA komplemen
DNA komplemen atau DNA pelengkap, atau jauh lebih dikenal dengan singkatannya cDNA (dari complementary DNA), merupakan DNA untai tunggal sintetik/buatan yang disalin dari untai mRNA menggunakan teknik PCR dengan memanfaatkan enzim transkriptase balik.[1] Penggunaan cDNA ini sangat luas, terutama dalam analisis ekspresi genetik dan transkriptomika.[1] mRNA berkas tunggal atau transkriptom bersifat tidak stabil karena mudah dicerna dan dilebur dalam sel. Pengubahan mRNA berkas tunggal menjadi cDNA membuatnya lebih mudah dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur).[1]
Sintesis
suntingSintesis cDNA ini dilakukan dengan mengunakan enzim reverse transcriptase dan primer oligo dT yang akan menempel pada daerah ekor poli A yang merupakan ciri khas dari mRNA. Hal ini dilakukan supaya mRNA yang digunakan dapat di amplifikasi saat dilakukan pengecekan dengan menggunakan PCR.[2] Dalam melakukan sintesis cDNA diperlukan beberapa tahapan, yaitu isolasi mRNA yang akan digunakan, visualisasi dengan menggunakan elektroforesis, sintesis cDNA untai pertama dan amplifikasi cDNA yang didapatkan.[2]
- isolasi mRNA: mRNA yang digunakan merupakan hasil isolasi dari eukariot. mRNA digunakan karena lebih spesifik terhadap ekspresi gen yang dihasilkan.[2] mRNA digunakan karena pada mRNA terdapat ekor polyA karena adanya proses poliadenilasi yang tidak dimiliki oleh RNA lainnya, seperti rRNA dan tRNA.[2]
- visualisasi: menggunakan gel agarosa untuk mengetahui hasil isolasi.[2]
- sintesis cDNA untai pertama: pada tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari cetakan mRNA dengan bantuan primer oligo dT yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA.[2] Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa.[2]
Terdapat 2 enzim yang berperan dalam proses sintesis cDNA, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow fragment) dan S1 nuklease.[2]
Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah terdegradasi, selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat permanen.[3] cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai vektor kloning seperti plasmid, kosmid, dan bakteriofage, dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA genomik yang kompleks.[3] Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ sekuen yang terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon.[3]
Aplikasi
suntingIsolasi RNA dan sintesis cDNA dapat juga digunakan untuk kloning suatu gen karena biasanya gen yang dikloning merupakan urutan DNA tanpa intron, gen ini yang menyandikan sifat tertentu ke tanaman lain untuk membuat tanaman transgenik atau dapat pula kloning gen penyandi protein atau enzim tertentu pada tanaman ke bakteri atau vektor lainnya seperti khamir atau biakan sel sehingga produksinya dapat meningkat sesuai dengan kebutuhan yang diinginkan.[4] Contohnya dalam pembuatan tanaman transgenik Abaka yang tahan terhadap serangan cendawan Fusarium dengan menyandikan gen beta-1,3 glukanase yang diambil dari cendawan lain yaitu Trichoderma asperillum.[4]
Aplikasi lainnya, cDNA ini digunakan sebagai kofaktor untuk HIV-1 berfusi dan masuk kedalam sel manusia.[5] Rekombinan cDNA ini menghambat ekspresi dari CD-4 untuk memediasi HIV-1 untuk masuk dan menginfeksi sel manusia.[5] Aplikasi ini sangat membantu dalam perkembangan di bidang medis, terutama untuk penyakit yang belum dapat ditemukan cara penanganannya.[6] Walaupun metode ini belum dapat mengobati, namun metode ini dapat menghambat ekspresi dan infeksi dari penyakit tersebut.[6]
Pranala luar
suntingReferensi
sunting- ^ a b c (Inggris) Xu Yunbi. 2010. Molecular Plant Breeding. Oxford (UK): CABI.
- ^ a b c d e f g h (Inggris) Allison LA. 2007. Fundamental Molecular Biology. Blackwell: Oxford.
- ^ a b c (Inggris) Farrell RE. 2010. RNA Methodologies: Laboratory Guide for Isolation and Characterization. London: Elsevier.
- ^ a b Purwati RD, Sulistyowati L. 2012. Transfer gen β-1,3-Glucanase dari jamur Trichoderma asperillum pada kalus abaka untuk ketahanan terhadap penyakit layu Fusarium. Jurnal Litri 18(1): 24-30.
- ^ a b (Inggris)Yu Feng, Christopher C. Broder, Paul E. Kennedy, and Edward A. Berger. 2011. HIV-1 Entry Cofactor: Functional cDNA Cloning of a Seven-Transmembrane, G Protein–Coupled Receptor.J Immunol. Jun 1, 2011; 186(11): 6076–6081.
- ^ a b (Inggris)John M. Walker,Ralph Rapley. 2005. Medical BioMethods Handbook. New Jersey: Humana.