DNA ligase
DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick.[1] Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan.[1] Secara biologis, DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA.[2] Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase.[3] Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan mati.[3] DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun di luar sel.[4] Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan.[4] Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempat yang spesifik.[4] Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.[4]
Jenis-Jenis DNA Ligase
suntingDNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu NAD+ atau ATP.[1] DNA ligase NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri.[1] Sementara itu, DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus.[1] Walaupun kedua jenis enzim ini memerlukan kofaktor yang berbeda, keduanya memiliki mekanisme katalitik yang sama.[2] DNA ligase ATP-dependent yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase.[2]
T4 DNA Ligase
suntingT4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage.[5] Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul.[5] Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar.[5] Proses ligasi DNA T4 memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan konsentrasi 0.25-1 mM.[5] Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu.[5] Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C.[5] Sementara itu, jika ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4 °C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.[5]
T7 DNA Ligase
suntingT7 DNA ligase merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa.[2] DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri dari dua domain dengan sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang lebih besar.[2]
Mekanisme DNA Ligase
sunting
Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP.[1] Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa NAD+.[1] Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.[1]
Referensi
sunting- ^ a b c d e f g h Gul S et al. 2004. Staphylococcus aureus DNA ligase: characterization of its kinetics of catalysis and development of a high-throughput screening compatible chemiluminescent hybridization protection assay. Biochem J 383(3): 551-9.
- ^ a b c d e http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/xtal/teach/repl/ligase.html[pranala nonaktif permanen]
- ^ a b Miesel L, Kravec CV, Ma S, McMonagle P, Palermo R. 2002. A High Throughput Assay of Bacterial DNA Ligase for Antibacterial Drug Discovery. Abstr Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother 42: 27-30.
- ^ a b c d Goodsell DS. 2004. DNA ligase. [terhubung berkala]. http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html[pranala nonaktif permanen] [2 Apr 2010].
- ^ a b c d e f g Bowen RA, Austgen L, Rouge M. 2002. DNA ligation. [terhubung berkala]. http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html[pranala nonaktif permanen] [2 Apr 2010].